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首頁-譜標(biāo)服務(wù)-質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì):二手串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS,LC-MS/MS~

質(zhì)譜技術(shù)與蛋白質(zhì):二手串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS,LC-MS/MS~

發(fā)布時(shí)間:2019-07-02       點(diǎn)擊次數(shù):10641

在蛋白質(zhì)組的研究中,蛋白質(zhì)和多肽的序列分析已不局限于闡明蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),對翻譯后的修飾的進(jìn)一步分析也是蛋白質(zhì)化學(xué)的一項(xiàng)重要任務(wù)。這種修飾對于蛋白質(zhì)的功能非常重要,如:細(xì)胞識別中的蛋白質(zhì)相互作用,信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)定位。
一, 蛋白質(zhì)的糖基化

糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)部,細(xì)胞膜和細(xì)胞外均有發(fā)現(xiàn),大部分蛋白質(zhì)是糖蛋白。對糖蛋白的檢測和分析發(fā)現(xiàn),糖蛋白中糖組分的結(jié)構(gòu)和功能具有多樣性。糖蛋白中的糖通常是不同種類的,而且是由一些可控?cái)?shù)量的單糖組成。糖基化的多樣性與細(xì)胞周期,細(xì)胞分化和發(fā)展的狀態(tài)有關(guān)。在蛋白組時(shí)代中,蛋白質(zhì)的修飾會(huì)引起其理化性質(zhì)的改變,因此是不容忽視的。

從1D或2D凝膠得到的糖基化蛋白的識別,一般是進(jìn)行MALDI-MS指紋分析,或是對MALDI-PADESI-MS/MS得到的碎片譜進(jìn)行分析。對完整的糖蛋白的研究是非常困難的,所有已知的離子化技術(shù)都有其局限性。目前,人們主要研究糖肽,其好處之一就是質(zhì)量減小了,這就會(huì)得到更好的分辨率,而且糖肽仍保留了糖基化位點(diǎn)。將分離的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可進(jìn)行糖肽的研究。一旦糖肽被識別出,就可以用串連質(zhì)譜(ESI-MS/MS)來闡明肽序列。當(dāng)?shù)鞍椎男蛄幸阎獣r(shí),計(jì)算質(zhì)量差就可推出其上附著的寡糖的質(zhì)量。

要將糖部分從糖蛋白中釋放出來,可用化學(xué)切割或酶切割。目前,連有結(jié)構(gòu)專一性糖苷酶的質(zhì)譜在提供序列,分支和鏈接數(shù)據(jù)方面是最有力的技術(shù)。對于N糖基化常用的糖苷內(nèi)切酶有PNGase-F,PNGase-A,EndoF和EndoH?;瘜W(xué)切割也可以用來釋放O-連接和N-連接的多糖,但經(jīng)常出現(xiàn)的缺點(diǎn)是他會(huì)完全破壞所有的肽鍵,因而丟失了關(guān)于糖附著位點(diǎn)的信息。而且這些切割不能從糖肽中連續(xù)釋放單糖。用肼的化學(xué)切割可以除去兩種類型的糖基化。在60℃可專一性的釋放O-連接的糖,而在95℃能釋放N-連接的糖。釋放O-原子更常用的方法是用堿進(jìn)行β消除。通常,糖基中加入金屬離子在MALDI和ESI中離子化。用MALDI-MS分析糖類的一個(gè)好的選擇是將之與其他一些化合物混合,這樣可以進(jìn)一步提高靈敏度和分辨率。不同的質(zhì)譜方法可以產(chǎn)生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞誘導(dǎo)解離(CID)譜,這可以給出有關(guān)糖的序列,分支及糖間的連接等信息。

                              

 

二, 蛋白質(zhì)的磷酸化
蛋白質(zhì)中氨基酸的磷酸化在生命系統(tǒng)中起重要的作用。磷酸化經(jīng)常作為分子開關(guān)控制不同過程蛋白質(zhì)的活性,如新陳代謝,信號傳導(dǎo),細(xì)胞分裂等過程。因此,蛋白質(zhì)中磷酰氨基酸的識別在蛋白質(zhì)分析中是一項(xiàng)重要的工作。

已知的磷酰氨基酸的類型有四種:
(1)O-磷酸鹽,通過羥氨酸的磷酸化形成的,如絲氨酸,蘇氨酸,酪氨酸。
(2)N-磷酸鹽,通過精氨酸,賴氨酸或組氨酸中的氨基的磷酸化形成的。
(3)乙酰磷酸鹽,通過天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。
(4)S-磷酸酯,通過半胱氨酸的磷酸化形成的。
用質(zhì)譜分析磷酸化時(shí)主要存在的問題是,混合物中磷酸化肽的信號被抑制。因此只有當(dāng)一些非磷酸化肽的含量降低(或磷酸化的肽被富集)后,分析磷酸化的肽才會(huì)變得容易些。一些相應(yīng)的用于質(zhì)譜分析的前磷酸化肽或磷酸化蛋白質(zhì)的分離和富集方法和技術(shù)已有所發(fā)展,現(xiàn)已建立的分離技術(shù)有:雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP),高分辨率的凝膠電泳(2DE)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)。對于32P標(biāo)記的磷酸化肽或蛋白可用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測,提取后可以高靈敏度MALDI-MS分析;如果32P標(biāo)記不可行,就要用二手LC-MS/MS分析,常用HPLC與質(zhì)譜聯(lián)用。

常用的富集方法有:固定金屬親和色譜(IMAC),IMAC是選擇性分離和富集磷酸化肽最廣泛的方法。此方法中,鍵合在螯合底物上的金屬離子(通常是Fe3+或Ga3+)選擇性地與磷酸化肽中的磷酸部分相結(jié)合, 并且在高pH或磷酸緩沖液中磷酸化肽可以釋放出來??贵w免疫沉淀,高親和性抗體可以從復(fù)雜混合物中免疫沉淀特定的蛋白。目前利用抗體富集蛋白/肽僅局限于分析磷酸化酪氨酸,然后用MALDI-TOF MS分析與抗體相聯(lián)接的磷酸化肽。盡管用于免疫沉淀的抗體對其底物必須有相對高的親和力,但低親和力抗體仍然可以有效地用于免疫印跡Western-blotting分析。化學(xué)修飾,已建立了兩種從復(fù)雜混合物中專一分離磷酸化蛋白/肽的方法。但兩種方法都有待進(jìn)一步優(yōu)化以鑒定低豐度蛋白質(zhì)。

磷酸化肽的檢測和磷酸化位點(diǎn)的確定主要MS技術(shù):MALDI-TOF MS可以通過肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質(zhì),與磷酸酯酶處理相結(jié)合可以確定磷酸化位點(diǎn)。其原理是磷酸酯酶處理后,磷酸化的肽丟失磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生特定質(zhì)量數(shù)的變化,MALDI-TOFMS通過檢測這種質(zhì)量數(shù)的變化而確定磷酸化位點(diǎn)。二手串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)可進(jìn)行前體離子掃描,這一方法是通過檢測磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的特定片段來報(bào)告磷酸肽的存在。磷酸化肽經(jīng)CID后會(huì)產(chǎn)生磷酸基團(tuán)的特異性片段,這些特異性的片段在用二手串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行前體離子掃描時(shí)可作為磷酸肽的“報(bào)告離子”。二手串聯(lián)質(zhì)譜還可進(jìn)行中性丟失掃描,這種方法是用MS/MS檢測經(jīng)CID后發(fā)生中性丟失H3PO4(98 u)的肽段。另外,由于液相色譜分離肽降低了離子抑制效應(yīng),也有人用二手LC-MS/MS分析磷酸化位點(diǎn)。傅立葉變換質(zhì)譜進(jìn)行電子捕獲解離 電子捕獲解離(ECD)與傅立葉變換離子回旋加速共振(FTICR)質(zhì)譜相連是蛋白質(zhì)、肽測序和研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一個(gè)有力方法。

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